化学发光失控,原因竟是……

作者:叶青 李蔼文 邓超  广东省第二中医院检验科 2022-05-11

在化学发光与电化学发光免疫检测中,除了常用的发光底物如吖啶酯、三联吡啶钌、抗原、抗体、缓冲液等,还有一个非常重要的材料,就是结合酶联免疫分析方法的磁珠。


磁珠具有超强的顺磁性,在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能够均匀分散,其具有丰富的表面活性基团,可以和生化物质偶联,并在外磁场的作用下实现与待测物质的分离。


在化学发光分析中,通常采用磁珠作为固相吸附材料。其中应用最为广泛的是将链霉亲和素结合在磁珠上[1],通过生物素和链霉亲和素之间的强结合力来捕获含有生物素的发光物质,再通过磁珠的磁性以达到分离,并通过对发光信号的检测以实现对待测物质的定量测定。


磁珠本身虽然与发光物质无关,却可通过其磁性对发光物质进行捕获,因此,反应体系中磁珠量的变化可能也会对光信号产生影响,从而影响检测结果[2]


随着磁珠化学发光技术的广泛应用,很多不同品牌的发光试剂均采用磁珠包被特异性性受体、抗体等,一旦保存或使用不注意,磁珠浓度过高或过低,均会影响到检测结果。下面分享前段时间遇到的一次踩“坑”案例,看看笔者是如何抓住这调皮的小磁珠的。




2月24日早晨,笔者如常对电化学发光仪进行室内质控检测。在查看质控结果的过程中,发现总前列腺特异性抗原(以下简称TPSA)质控结果低值和高值都突然偏低,并且两个值都超过3SD。质控结果如下(见图1):


图1 TPSA室内质控图


随机误差?系统误差?笔者随即屏蔽该试剂检测,按照实验室质量管理的六大要素“人、机、料、法、环、测”进行查找原因。



01 排除人为误差:

仪器采用第三方常规免疫、肿瘤标志物、原装配套等几种质控品,需要人为添加至反应杯检测,因其它质控品项目均在控,所以排除笔者混淆质控的放置顺序引起的人为误差。


02 排除质控品问题

因同一质控品其它项目均在控,所以排除质控品人为溶解误差或变质。为了避免质控品有气泡引起的吸样偶然误差,因此重新仔细检查当天的质控品,在确定没有微小气泡的情况下,重新上机检测。但是重测结果还是一样,排除随机误差。


03 查看试剂校准记录

查看试剂批号和校准记录,发现最近并没有更换新批号试剂,之前质控也一直在控,可以排除试剂批间差带来第三方质控引起的系统误差。


04 查看试剂及仪器记录

查看工作日志与仪器报警记录,发现仪器未发生影响检测质量的报警。在添加试剂记录那栏,发现质控失控的试剂是昨天上午新添加的一盒试剂,然而因为昨天仪器还有一盒快使用完的试剂,因此昨天上午质控检测的是旧试剂,所以并没有失控。

会不会是新加入的这盒试剂有问题?要不要换盒新试剂试试?笔者在等待停机和新试剂复温的时候,翻看仪器和LIS昨天患者的结果,发现上午患者检测使用的是旧试剂,结果有正常和异常,但是到了下午,仪器使用的是新试剂,该项目结果正常而且偏低,几乎与游离前列腺特异性抗原(FPSA)持平。由于昨天下午标本不多,3个正常偏低的结果并未引起值班同事的注意。看到这,笔者心里“咯噔”一下,昨天下午有可能发的结果偏低。


为了继续验证,待仪器停机后,笔者拿出质控失控的试剂,放入新试剂,启动后对新试剂进行质控检测,室内质控结果高低值均在控。谨慎起见,为了排除质控品的“基质效应”,随即挑选昨天上午5个正常与异常患者标本,下午的患者标本因为没有几个,全部挑选出来进行比对。最后结果出来了,上午比对的结果全部在可控偏倚范围内,下午的结果全部增高。(见表1)


表1 标本比对

注:PSA参考范围:0-4ng/mL,1/3TEA:8.33


至此,可以明确的是质控失控的试剂出现了问题。所幸的是,昨天下午误发的结果不多,都是病房的,复查前后都是正常范围,并没有对临床诊断及用药造成影响。于是笔者及时与临床进行更正说明,取消审核后重新发报告。由于当天的标本该项目失控后未进行检测,及时发现原因并处理,重新上机,并没有造成大的取结果时间延误。


如此“触目惊心”的失控问题,到底是试剂变质了还是其它原因?当笔者打开试剂时,发现试剂状态如下(图2):


图2 TPSA试剂图片


部分调皮的磁珠粘附在试剂的透明瓶盖上,导致试剂内磁珠浓度偏低,影响检测结果。吸取微量该试剂内液体混匀瓶盖上的磁珠并吸走,将其全部挪至试剂内,后续上机质控与标本检测,均恢复正常。


电化学发光免疫测定是电化学发光与免疫测定相结合的产物。其标记物的发光原理与一般的化学发光不同,用电化学发光剂三联吡啶钌标记Ab,通过Ag-Ab反应和链霉亲和素包被的磁珠分离技术,根据三联吡啶钌在电极上发出的光强强度对检测的Ag或Ab进行定量或定性测定。其中,三联吡啶钌与链霉亲和素包被磁性颗粒是电化学发光反应的重要因素。


其独特的磁性微粒作为固相载体(图3),直径2.8μm,表面凹凸使包被面积放大;悬浮于反应体系中,形成均一稳定的液相,大大提高反应效能;磁性微珠易于通过磁场,通过磁性吸引和分离。(图4、图5)


图3 电镜下的磁珠(来源于厂家)


图4 与磁珠结合的抗原抗体图(模拟图,来源于厂家)


图5 磁性微粒移至有磁铁的测量室(模拟图,来源于厂家)


以本案例的TPSA试剂为例,其试剂的主要成分有三个,M、R1、R2。(如图6)


图6 TPSA试剂


M: 链霉亲和素包被的颗粒:0.72mg/mL(透明盖)

R1:生物素化抗前列腺特异性抗原的抗体(灰色瓶盖)

R2:钌标记抗前列腺特异性抗原的抗体(黑色瓶盖)


其反应原理采用双抗夹心法,20μL的样本、一份生物素标记的PSA特异性单克隆抗体和一份钌复合物标记的PSA特异性单克隆抗体反应形成“三明治”样抗原抗体复合物,经孵育后加入链霉亲和素包被的微粒,复合物在链霉亲和素和生物素相互作用下结合至固相。


将反应液吸入检测池中,检测池中的微粒通过电磁作用吸附在电极表面。未结合的物质通过ProCell/ProCellM除去。在电极上加以一定的电压,使复合物发光,用光电倍增管检测发光的强度。(图7)


图7 双抗夹心法(模拟图)


因此,在应用磁珠的化学发光检测中,光信号减弱可导致夹心法项目检测结果假性降低而竞争法项目检测结果假性升高。经研究发现,磁珠浓度在0~0.36mg/mL时,在夹心法模式和竞争法模式中,磁珠浓度均与光信号呈正相关;当磁珠浓度在0.36~0.72mg/mL时,光信号保持稳定;而当磁珠浓度>0.72mg/mL时,在两种模式中,磁珠过多可能会导致对光信号接收识别产生屏蔽作用呈负相关[2]


正常的TPSA试剂链霉亲和素包被的磁性颗粒为0.72mg/mL,若磁珠粘附在瓶盖上的量过多时,必将导致瓶内磁珠浓度低于0.36mg/mL,进而导致发光信号减弱,结果偏低。


化学发光磁珠试剂在运输和储存以及使用的过程中,试剂盒如果倾斜或倒置,可导致磁珠粘附在试剂瓶身或试剂盖子上。储存试剂时避免贴壁,特别是后壁容易结冰的冰箱,会导致磁珠结成块。因此,添加试剂时需检查试剂瓶盖有无粘附磁珠,从2-8℃冰箱取出准备使用时,最好放置室温半个小时以上再使用。本案例TPSA试剂采用双抗夹心法,加入时,没有仔细检查,磁珠浓度偏低。因此导致检测结果假性降低,让笔者踩“坑”。


这个“坑”也不是个例。有文献报道采用夹心法模式的肌钙蛋白检测结果假阴性而使心肌梗死患者被漏诊,从而丧失最佳救治时间[3-4]。因此,完善质控及其信息技术手段很重要。处理对策有:


1.实施换瓶质控:这个使用得最多,直接在仪器质控系统设置实现。


2.标本比对:没有质控品或想节省质控品的可以实施,根据WS/T407-2012《医疗机构内定量检验结果的可比性验证指南》,选择与2个不同浓度质控相近的患者标本(包括正常与异常)进行比对。


3.设置逻辑关系校验:对有逻辑关系的项目实施检验校验,比如FPSA不能大于TPSA等,通过信息手段拦截,及早发现问题。


4.实施PBRTQC:有条件的实验室还可以实施基于患者标本检测结果的实时质控(PBRTQC),利用现代实验室信息系统条件改进实验室质量控制体系。PBRTQC相比常规室内质控,更符合真实的实验室情况,无基质效应、无互换性等问题,具有连续监测、无需质控品、低成本等优势,未来应用广泛。


在保证仪器正常运行的情况下,要确保检验结果的准确可靠,除了需要严格按照操作规程进行外,还需要一双善于发现各种“坑”的慧眼及各种信息技术手段。


1、按照运输要求,试剂盒外包装上都标有竖直向上的标志,如下(见图8),在试剂运输以及储存都需要注意按照竖直向上方向放置。


图8 新产业和罗氏试剂盒


2、在添加新试剂的时候,应该注意磁珠试剂的磁珠浓度是否和平常一致。如出现粘附试剂瓶壁或者瓶盖的情况,需手动将试剂磁珠进行混匀再上机检测。如果发现磁珠已经结块,不能混匀的情况,应该与试剂厂家联系,沟通排查是否是该批次的试剂出现问题还是运输存储问题。


3、影响磁珠的因素除了试剂盒本身外,还有仪器的混匀系统也很重要(有没有搅拌/搅拌不充分/有气泡)。


4、经笔者询问得知,上一年笔者实验室的其它品牌仪器也发生过类似由于磁珠浓度导致的检测问题。但由于是偶发现象,当时并未引起重视。这次再发生磁珠意外事件,笔者所在实验室也重新规范了质控监控流程,将每瓶新上机的试剂至少进行一次室内质控监测,保证排除由于试剂新添加问题造成的检测误差。


希望通过这次笔者的踩“坑”介绍,让各位同行避免重复踩“坑”,让调皮的小磁珠更好地安分工作。


编辑:骆秉涵

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