核酸混采的科学依据再议
序贯检测或顺序检测（Hierarchical testing or Serial testing） 序贯检测或顺序检测是最常使用的一种混样检测方式，一般分为2段也可以多段，先进行n合1混样，混合检测阳性的，拆分为单管检测。
陈列检测（Array testing） 陈列检测是先将样品排列为n×n的陈列，分别将行和列分别混样，然后将有阳性的行和列的所有样品拆分为单管检测。
二、“混采”检测与“混合样本”检测
1.概念
这两个概念比较容易混淆，我并没有找到比较权威的概念，目前的解释应该是大家约定俗成的。也有将混样检测等同于混合样本检测。本文中的混样检测为一个广义的概念既包含“混采”检测也包含“混合样本”检测。
1）“混采”是指采样时将样本放入同一个采样管中混合。
《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》中指出“针对新冠病毒核酸10合1混采检测（10-in-1 test）技术（指将采集自10人的10支拭子集合于1个采集管中进行核酸检测的方法）”。混采技术规范的汇总可以参见20合1来了！混样检测的极限在哪里？
2）“混合样本”是指采样后，将样本等比例取出再进行混合。
在《新冠病毒核酸筛查稀释混样检测技术指引》提到“样本混合。将采集的数个样本（原则上不超过5个）各取200ul进行充分混合，形成混合待检样本。”
2.对病毒浓度的影响
根据卫健委发布的系列混采检测技术规范，规范中规定了病毒保存液的体积，比如单检和5合1要求2-3mL，10合1要求6ml，20合1要求11-12ml。
我们假设单人单检的病毒浓度是1；
5合1：混采检测的病毒浓度仍然是1，混合样本检测，则病毒浓度为1/5；
10合1：混采检测，由于保存液体积为单检的2倍，病毒浓度为1/2，但是如果采用混合样本检测，则病毒浓度为1/10；
20合1：混采检测，由于保存液体积为单检的4倍，病毒浓度为1/4，但是如果采用混合样本检测，则病毒浓度为1/20。
因此在相同条件下采用混合样本检测，病毒浓度只有混采检测的病毒浓度的1/5。
混采数量 | 保存液体积（ml） | 混采检测的病毒浓度 | 混合样本检测的病毒浓度 |
单检 | 3 | 1 | 1 |
5合1 | 3 | 1 | 1/5 |
10合1 | 6 | 1/2 | 1/10 |
20合1 | 12 | 1/4 | 1/20 |
《新型冠状病毒肺炎防控方案（第九版）》“新冠病毒标本采集和检测技术指南”中也规定“确诊病例、无症状感染者、入境人员、密切接触者和密接的密接在住院、隔离观察或健康监测期间应“单采单检”，即单独采集个体的标本，单管进行核酸检测，不得进行混采混检。”
农业农村部发布的《养猪场非洲猪瘟变异株监测技术指南》中也提出“病原检测如果混检，建议混样数量不超过5个；抗体检测不得混样。”
4.混检阳性与单检阳性
《新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范》中规定“（二）阳性结果复核
1、混采检测结果为阳性、灰区或单个靶标阳性，通知相关部门对该混采管的20个受试者暂时单独隔离，并重新采集单管拭子进行复核。
2、复核单管核酸检测如均为阴性，则按照阴性结果回报。暂时隔离人员即解除隔离；如检测结果阳性，按程序上报。”
大家对于混样检测的主要的担心是假阴性结果，即“漏检”，却很少有人担心假阳性结果，即“错检”，当多种不同的来源的样本混合在一起时会发生无法预测的各种非特异反应，虽然发生概率比较低，但是发生这种情况也是正常的。
三、混样检测的效能公式
之前写过混样检测的数学原理 里面介绍的混样效能计算的公式：
当混样的结果中只有阴性或阳性，每次试验都是相互独立的随机事件。
阳性率为，混样数量为
，则有：
通过混样效能公式可以计算出最佳的混样数量，但是这个公式也存在问题，就是假设混样后的检测方法敏感性和特异性不变。但是实际情况是，一个试剂的敏感性和特异性的验证试验主要针对单检样品获得的。对于混采后的样品的检测，由于病毒浓度降低，针对混样检测试剂的敏感性和特异性也会改变。因此混样检测的效能公式里需引入检测试剂的敏感性和特异性，修改后的效能公式为：
当流行率大于5%时，混样的优势就不是很显著了，所以建议混样的前提是流行率低于5%，混样的数量5-20，采用混采的方式进行混样检测。
四、用于混样检测试剂的验证
参照FDA发布的“Amending Certain EUAs for RT-PCR Molecular-based Diagnostic Tests to Authorize the Detection of Nucleic Acid from SARS-CoV-2 from Pooled Anterior Nasal Respiratory Specimens for Screening When Used as Part of a Serial Testing Program”本标准是用于试剂进行混样检测时的一个补充要求。
1.拭子混采5合1的验证（Swab pooling up to n=5）
1) LOD的验证（Validation of Expected Limit of Detection (LoD)）
样品：已知浓度copies/mL的灭活病毒或阳性临床样本，阴性鼻拭子样本；
5合1混样制备：通过将已知浓度的灭活病毒或定量阳性患者样本加到拭子上来制备单个阳性拭子。添加转运培养基的其余四个拭子应仅包含阴性临床基质。转运培养基的最终浓度必须约为先前授权测定的 LoD 的 3 倍。使用在LoD研究中的相同体积的缓冲液测试至少20个独立提取重复的单个拭子。平行测试20个的5混1样品，每个混样在转运培养基中包含1个阳性拭子和4个单独的阴性拭子。
验证参数：
≥95%混样检测重复为阳性； 单检和混检的Ct差异不超过1.7 Ct，并且 混检程序无效的比例不超过5%。
2)高浓度样品的验证（Validation of High Viral Concentrations）
样品：准备3个10^6 copies/mL的灭活病毒或阳性临床样本，阴性鼻拭子样本；
5合1混样制备：测试10个重复的5合1混采转运培养基，其中包含3个阳性拭子和2个阴性拭子的转运培养基。
验证参数：
10个混样检测重复均为阳性； 混检程序无效的比例不超过5%。
2.拭子混采10合1的验证（Swab pooling up to n=10）
1) LOD的验证（Validation of Expected Limit of Detection (LoD)）
样品：已知浓度copies/mL的灭活病毒或阳性临床样本，阴性鼻拭子样本；
10合1混样制备：通过将已知浓度的灭活病毒或定量阳性患者样本加到拭子上来制备单个阳性拭子。添加转运培养基的其余9个拭子应仅包含阴性患者临床基质。转运培养基的最终浓度必须约为先前授权测定的 LoD 的 3 倍。使用在LoD研究中的相同体积的缓冲液测试至少20个独立提取重复的单个拭子。平行测试20个的10混1样品，每个混样在转运培养基中包含1个阳性拭子和9个单独的阴性拭子。
验证参数：
≥95%混样检测重复为阳性； 单检和混检的Ct差异不超过1.7 Ct，并且 混检程序无效的比例不超过5%
2)高浓度样品的验证（Validation of High Viral Concentrations）
样品：准备3个10^6 copies/mL的灭活病毒或阳性样本，阴性鼻拭子样本；
10合1混样制备：测试10个重复的10合1混采转运培养基，其中包含3个阳性拭子和7个阴性拭子的转运培养基。
验证参数：
10个混样检测重复均为阳性； 混检程序无效的比例不超过5%。
3.保存液5合1的验证（Media pooling up to n=5）
1) LOD的验证（Validation of Expected Limit of Detection (LoD)）方法1
阳性样本浓度必须约为先前授权测定的 LoD 的 5 倍。测试至少20个独立提取重复的单个样本。平行测试20个的5合1样本，每个混样包含1份阳性样品和4份单独的阴性样本。
验证参数：
≥95%混样检测重复为阳性； 单检和混检的Ct差异不超过1.7 Ct，并且 混检程序无效的比例不超过5%
2) 一致性验证（Validation of the Effect on the Percent Agreement）方法2
20个阳性样本和80个阴性样品随机组成20组5混1混样。用于此验证研究的阳性临床样本中，至少有 20% 应为弱阳性，对于 5 合1的混样，弱阳性的值应为先前授权的 LoD 时的平均 Ct 的 2.32 Ct 以内。
验证参数：
混样检测与单检的符合率≥85%； 混检程序无效的比例不超过5%
4.保存液10合1的验证（Media pooling up to n=10）
1) LOD的验证（Validation of Expected Limit of Detection (LoD)）方法1
阳性样本浓度必须约为先前授权测定的 LoD 的 10 倍。测试至少20个独立提取重复的单个样本。平行测试20个的10合1样本，每个混样包含1份阳性样品和9份单独的阴性样本。
验证参数：
≥95%混样检测重复为阳性； 单检和混检的Ct差异不超过1.7 Ct，并且 混检程序无效的比例不超过5%
2) 一致性验证（Validation of the Effect on the Percent Agreement）方法2
20个阳性样本和180个阴性样品随机组成20组10混1混样。用于此验证研究的阳性临床样本中，至少有 20% 应为弱阳性，对于 10合1的混样，弱阳性的值应为先前授权的 LoD 时的平均 Ct 的 3.32 Ct 以内。
验证参数：
混样检测与单检的符合率≥85%； 混检程序无效的比例不超过5%
混样检测很容易上瘾，一旦习惯了混样就很难回到单采单检了，因为它真的省钱，应该有不少老板和领导跃跃欲试的想尝试50合1甚至100合1了。具体混多少合适不是老板和领导拍脑袋出来的，而是使用混样检测效能公式结合流行率、试剂敏感性和特异性计算出来的。除此之外，用于混样检测的试剂也应该进行混检的验证，否则只能是得不偿失。
