微小RNA标志物在胃癌诊断中的临床应用价值

作者:贺琳娟 2022-07-25
作者单位:觅瑞(杭州)生物科技有限公司

贺琳娟,觅瑞(杭州)生物科技有限公司医学市场部经理,杭州师范大学硕士,先后发表论文5篇,申请专利2项。


胃癌是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤。据2022年2月国家癌症中心(NCC)公布的最新数据,2016年我国新发癌症病例约406.4万例,其中胃癌的新发病例约为39.7万例,死亡病例为28.9万例,为我国第三大癌症。胃癌一般通过患者的临床表现结合内镜及组织病理学、影像学检查等进行诊断和鉴别诊断。早期胃癌患者常无明显特异性症状,随着病情进展才会出现类似胃炎、溃疡的症状,因此发现胃癌时常处于中晚期,预后较差[1]。据国内外统计报道,日本的胃癌综合治愈率高达80%,Ⅰ期胃癌甚至达到了98.1%,远超中国的30%~40%,这与日本自2013年就开始进行胃癌筛查有关[2]。但绝大多数国家不能普及内镜筛查,因为内镜检查成本高,具有侵入性且依从性差,因此亟需开发一种新的标志物对胃癌进行精准早筛。


微小RNAs(miRNAs)是一类长约18~25个核苷酸的内源性非编码RNA分子,可存在于唾液、痰液、鼻腔分泌物、支气管肺泡灌洗液、尿液和血液等体液中。miRNAs常靶向一个或多个mRNA,通过抑制翻译或降解靶基因调节基因的表达[3]。近些年的研究结果显示,miRNA在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要的调控作用,并且与某些疾病的发生、发展存在着密切的联系,如肺结核、心血管疾病、糖尿病、阿尔茨海默病等[4-7]。促进血管生成、抗细胞凋亡、侵袭转移活化、免疫逃逸、生长抑制失效等是肿瘤发生、发展相关的重要特征[8],本文将miRNA在胃癌血管生成、细胞凋亡、转移和侵袭及诊断评估中的潜在价值等方面的研究进行论述。


一、miRNA在胃癌血管生成方面的作用


血管生成是癌症的基本标志,在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。血管的生成不仅为肿瘤细胞提供营养,还为远处转移提供了途径[9]。


血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)是参与肿瘤血管生成的重要调控因子,通过与其相应受体结合,增加血管内皮的通透性,促进内皮细胞的生长进而促进血管生成[10]。血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)是VEGF家族的一员[11],过表达的miR-205-5p通过诱导VEGFA和成纤维细胞生长因子1(Fibroblast Growth Factor 1,FGF1)的下调来抑制了血管生成和ERK信号通路,抑制胃癌细胞的增殖和集落生成[12]。Zhang等[12]研究发现,与正常的胃细胞相比,miR-205-5p在胃癌患者体内表达下调,促进了VEGFA和FGF1的表达,激活ERK信号通路促进癌变。还有研究结果显示,miR-574-5p可抑制酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型3(Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type 3,PTPN3)的表达,从而提高44/42 MAPKs的磷酸化水平,导致VEGFA表达的增加,从而诱导血管生成[13]。


三叶因子1(Trefoil Factor Family 1,TFF1)是三叶肽家族成员之一,对胃黏膜具有保护和修复作用,是一种肿瘤抑制因子[14-15]。Shi等[16]研究发现,miR-632在胃癌患者血清中呈高表达,与TFF1呈负相关,通过负调节胃癌细胞中的TFF1来促进血管形成和内皮细胞募集,促进胃癌的发展。


二、miRNA在胃癌细胞凋亡方面的作用


蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB)又称Akt,是PTEN/PI3K信号传导下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,活化的Akt是细胞存活因子,能降低凋亡因子的同时增强抗凋亡蛋白的活性[17]。研究发现,Akt能够直接磷酸化促凋亡分子BAD(Bcl-2/Bcl-xl associated death promoter),使Bcl-/Bcl-xl解聚,发挥抗凋亡作用,也能磷酸化forkhead家族转录因子,以此抑制凋亡基因的转录等,Akt可通过众多途径调节细胞凋亡[18]。Tian等[19]研究发现,与正常细胞相比,miR193b在胃癌细胞中表达降低,miR193b可受Akt信号通路的负调控,通过靶向KRAS 降低细胞活力,诱导细胞凋亡。

RNA结合基序4(RNA-Binding Motif 4,RBM4)是一种剪接因子,主要参与选择性剪接和mRNA翻译的调节,在细胞的增殖和凋亡中发挥着重要作用。研究结果显示,RBM4蛋白在胃癌细胞中表达下调,通过抑制MAPK通路蛋白的表达控制胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭[20]。Zhang等[21]运用qRT-PCR和Western blot技术检测胃癌组织和正常组织中miR-504和RBM4的表达,通过集落形成测定和流式细胞术评估细胞增殖和细胞凋亡,结果发现,与正常组织相比,miR-504在胃癌组织中表达上升,RBM4表达下降,miR-504通过靶向RBM4促进胃癌细胞增殖和抑制细胞凋亡。


三、miRNA在胃癌转移和侵袭方面的作用


Wnt/β-catenin信号通路在各种癌症的发生和发展中起重要作用,可增强细胞的迁移和肿瘤的侵袭。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对癌症的预防和治疗具有潜在意义。miRNA可通过靶向不同的Wnt相关基因参与Wnt/β-catenin信号通路[22]。裸角质层同源物1(naked cuticle homolog 1,NKD1)是经典Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子,在多种正常组织中广泛表达[23]。


Hu等[24]运用qRT-PCR技术发现miR-532在胃癌组织和细胞中表达上调,Transwell实验结果显示miR-532过表达促进了胃癌细胞的迁移和侵袭。Wnt/β-catenin拮抗剂NKD1是miR-532的靶点,miR-532可抑制NKD1的表达。TOP/FOP荧光素酶活性分析表明,miR-532过表达增加了Wnt/β-catenin信号通路的活性。这些研究结果表明,miR-532通过抑制NKD1和激活Wnt/β-catenin信号通路来促进胃癌细胞的迁移和侵袭。


上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)可激活和促进各类缺氧、癌症信号通路和肿瘤微环境信号,以此导致上皮细胞失去其细胞极性和细胞间的黏附性,使肿瘤细胞获得迁移和侵袭特性。Wnt/β-catenin信号通路可调节胃癌的EMT[25-27]。有研究发现,miR-214可通过靶向癌症相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)中的成纤维细胞生长因子9和调节胃癌细胞中的EMT过程抑制CAFs的促肿瘤作用。采用免疫荧光和Western blot分析检测转染了miR-214模拟物的CAF培养而来的胃癌细胞,发现E-cadherin的表达增加,而 Vimentin、N-cadherin和Snail的表达降低,表明胃癌细胞的EMT受到抑制[28]。

此外,越来越多的研究结果表明,miRNA在胃癌的细胞增殖、炎症反应、免疫逃逸等方面也发挥着重要作用,但具体的机制还有待研究。


四、miRNA在胃癌诊断中的潜在价值


生物标志物独立使用或与成像设备联合检测,可动态观察肿瘤的发生和发展、临床疗效评价和患者的预后,从而提高检出率和鉴别诊断的准确度。潜在的蛋白质生物标志物,如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、癌抗原72-4(CA72-4)、胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)I和PG II等已被验证了其有效性[1],但这些生物标志物在胃癌检测方面的敏感度、特异性和可复制性较为有限。


miRNAs在胃癌的诊断中具有潜在的价值。Chen等[29]运用qRT-PCR和电化学发光免疫分析法检测miR-421及CEA和CA125等传统肿瘤标志物的表达,通过比较受试者工作曲线下面积(Area Under the ROC Curve,AUC)评估各生物标志物对胃癌的诊断价值。研究结果显示,miR-421的AUC为0.981,灵敏度和特异性分别为96.67%和95.56%;CEA的ROC为0.672,灵敏度和特异性分别为67.06%和66.67%;CA125的ROC为0.645,灵敏度和特异性分别为45.59%和100.00%,这些结果表明,血浆miR-421对胃癌的诊断价值高于常规肿瘤标志物。Han等[30]研究胃癌患者和胃炎患者的血清miR-135和miR-20a,联合MDCT诊断,发现miR-135对胃癌的诊断价值为7.56,ROC为0.873,灵敏度为78.08%,特异性为79.61%;miR-20a的最佳诊断值为5.82,AUC为0.793,灵敏度为79.45%,特异性为71.84%。当miR-135和miR-20a联合MDCT作为组合诊断时,灵敏度为90.41%,特异度为93.20%,准确度为94.57%,联合检测的灵敏度、特异度和准确度均显着高于单一检测方法(P<0.01)。目前大部分研究还停留在实验阶段,尚未进入临床。


觅瑞研究团队通过一项涉及来自新加坡和韩国5248例样本的三阶段多中心临床试验,筛选出12个具有胃癌表达特异性的miRNA标志物,并对4566名高危人群进行了血清12-miR分子标志物、幽门螺杆菌感染和PG的检测,并且与胃镜的金标准进行比对。结果发现,在研发队列和验证队列中,12-miRNA组合的AUC分别为0.93和0.92。在前瞻性研究中,AUC为0.848,总体敏感度为 87.0%,特异度为68.4%,高于HP(0.635)、PG 1/2ratio(0.641)、PG指数(0.576)、ABC方法(0.647)、CEA(0.576)和CA19-9(0.595)[31]。基于以上研究,觅瑞自主研发了全球首个基于血液的微小核酸胃癌早诊试剂盒——GASTROClearTM,并在2019年经新加坡药监机构即新加坡卫生科学局(Health Science Authority)批准上市,用于胃癌的早诊临床应用,该试剂盒的实验室程序见图1。


12-miR多靶点qPCR分析是根据ISO13485医疗设备质量管理系统开发和制造的。通过组合基于苯酚/胍的血清样品裂解和基于二氧化硅膜的总RNA纯化来进行RNA的提取。在cDNA合成期间,使用相应的miRNA特异性逆转录引物在单个反应中将来自每个样品的miRNA转换为cDNA。在qPCR测定过程中,通过序列特异性正向PCR引物和半嵌套序列特异性反向PCR引物扩增每个miRNA靶标,并在单重反应中使用荧光定量进行检测。生物标志物和参考miRNAs的Ct值被整合到一个有效的、预先指定的逻辑回归算法中,用一个单一的数值分数来表示试验阳性或阴性。


图1. 12-miR多靶点分析的实验室程序


五、展望


胃镜是胃癌诊断的金标准,然而由于其侵入性、预约等待周期长等原因导致患者对胃镜检查的依从性不高,从而错过了胃癌早期发现后的最佳治疗时机。miRNAs生物标志物只需进行血液检测,可以配合胃镜用于对胃癌的风险分层,对其判定为高风险的人群建议进一步接受胃镜检查,从而在增加患者获益的同时,提高胃癌筛查效率。miRNAs在胃癌筛查中具有更大的人群覆盖面、更高的预测价值和最大程度的降低成本等特点,必将在胃癌的早期筛查中占据一席之地。


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