模式生物果蝇肿瘤研究平台构建及在抗肿瘤药物筛选中的应用
刘永琦，遗传学博士、教授、博士研究生导师。现任职于甘肃中医药大学。国家中医药管理局重点学科中西医结合基础学科带头人。教育部敦煌医学与转化教育部重点实验室副主任，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室主任。兼任甘肃省免疫学会副理事长等。荣获省科技进步奖7项，作为第一或通讯作者发表学术论文50余篇，其中SCI期刊论文20余篇。
和建政，博士、医学博士后、副教授、硕士研究生导师。现任职于甘肃中医药大学。发表国际高水平学术论文20余篇，其中在《Chemical Engineering Journal》、《Food and function》等国际知名期刊发表第一作者/通讯作者学术论文11篇，作为通讯作者在中文核心期刊发表论文5篇。
目前，恶性肿瘤已成为导致我国居民死亡的首要病因。2022年国家肿瘤临床研究中心最新发表的研究数据显示：2016年我国癌症新发病例406.4万，死亡人数为241.4万[1]。肿瘤病理学的复杂性和不断演变，使得研究者需要使用多种研究模型系统和跨学科方法才能更好的进行研究，即必须全面了解引起疾病发生和进展的机制，才能研究出适当的疗法。近几十年来，黑腹果蝇、斑马鱼和小鼠等经典的模式生物被广泛应用于研究人类肿瘤的发生机制和演变过程以及药物的研发[2]。
迄今为止，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为模式生物被广泛应用于人类肿瘤研究中，果蝇基因组测序已于2000年完成，在哺乳动物中，大多数控制细胞生长和侵袭的信号通路在果蝇中具有保守的功能，75%的人类已知致病基因与果蝇同源。果蝇具有体积小、操作方便、育种简单、成本低、生命周期短、繁殖速度快且数量多、表型易于分析等优点，已被广泛用于人类肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、药物成瘾和酒精中毒、衰老以及行为认知等的研究[3]。作为经典的模式生物，相关研究已获得6次诺贝尔生理学或医学奖。与哺乳动物相比，果蝇具有实验周期短、价格低廉和不受伦理学制约的特点，适用于大范围的药物筛选，是一个很好的优于体外药物筛选和临床哺乳动物药物筛选的模型。因此，本文对果蝇在肿瘤研究和抗肿瘤药物筛选的研究进行了综述，通过介绍果蝇在肿瘤研究中的应用、肿瘤研究平台的构建以及抗肿瘤药物筛选中的应用三方面进行总结。
一、在肿瘤学研究中的应用
与细胞培养模型相比，利用果蝇研究人类癌症的好处在于，它是一个复杂的“整个动物”系统，其器官和组织系统在稳态条件下协同作用，从而研究癌症进展的动态过程。果蝇作为一种模式生物比小鼠模型有一定的益处。果蝇利用其大量的遗传工具和易操作性，被应用于模拟肿瘤细胞迁移和转移中促进肿瘤发生的基因网络，很多研究在小鼠模型中被证明。为了在体内模拟肿瘤细胞的侵袭和转移，在果蝇翅成虫盘上皮细胞中表达致癌基因dRas1G12V（或简称为RasV12）[4]。这种致癌基因也被用于许多开创性的基因筛选，旨在识别可能与RasV12协同导致肿瘤过度生长的第二个基因位点突变。由于超过30%的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关，因此设计快速且特异的基因筛查以识别促瘤基因组合的能力使果蝇成为研究癌症的一个有吸引力的模型。此外，具有致癌Src64B（一种c-Src同源物）的果蝇翅膀表皮细胞克隆也与转移潜能有关[5]。在果蝇中构建了几种利用Ras和Src致癌基因的人类癌症模型，这为在体内研究Ras/Src驱动的肿瘤发生提供了一个极好的平台[6]。激活人类致癌基因Ras或Nocth同源基因的异位表达可以用来构建果蝇上皮的肿瘤模型，当这些致癌基因过表达于上皮细胞时，肿瘤在幼虫发育阶段不断生长[7]。这些肿瘤出现了与人类肿瘤许多相似的特征如细胞增殖增强、存活率增强、侵袭率增加等。果蝇作为体内研究模型可高效快速评估特定肿瘤基因的功能，为肿瘤的研究提供便利。
利用果蝇的研究帮助人们确定了决定组织稳态基本过程中的新机制，以及他们的破坏如何导致肿瘤发生。细胞竞争的概念首先在果蝇翅成虫盘中被发现，它描述了一种生物监测机制，可测定组织中相邻细胞之间的细胞适应性，确保健康细胞保持体内平衡[8]。根据环境的不同，癌细胞可以利用这种监测机制来竞争邻近的正常细胞以启动肿瘤生长，这一点在果蝇中首次得到证实[9]。原癌基因dmyc和Hippo途径已被证明在细胞竞争中发挥作用。激活dmyc和Hippo途径中的突变基因会导致细胞过度增殖，而抑制相邻细胞的增殖，这一过程称为超竞争[10]。由于Myc家族基因与人类癌症有关，以及Hippo通路失调在人类肺癌、结直肠癌、卵巢癌和肝癌中的影响，因此，超竞争被认为是一种癌症发生机制[11]。
二、肿瘤研究平台的构建
果蝇的主要优势是操作方便、成本低、拥有大量可用的遗传工具，有助于构建肿瘤研究平台。遗传工具有助于揭示细胞竞争和代偿性增殖等新机制，并建立各种癌症模型，这些模型可以概括疾病的各个方面，以便更详细地研究潜在机制。近年来，果蝇模型系统中的癌症相关研究有助于对该疾病复杂调控的理解，从而应用于人类疾病的靶向治疗。在果蝇中已应用的几种肿瘤模型都是使用了致癌基因过度表达和抑制肿瘤发生基因敲除来构建。常用的遗传工具有UAS-GAL4系统和RNA干扰系统等[12]。
操纵果蝇基因表达的现代遗传工具主要是从酵母中提取的UAS-GAL4系统。该工具是最常用的异位表达系统。GAL4作为转录激活因子表达后，能与上游激活序列（UAS）结合，驱动任何下游转基因元件的表达。在构建转基因果蝇时，通过显微注射的方法将这两部分分别整合在不同的果蝇中，单独含有UAS-靶基因或GAL4品系的转基因果蝇，不会在亲本中表达靶基因，只有将2种品系杂交后，靶基因才会在GAL4连接的特异性组织表达，实现时间和位置上的精准调控，从而在细胞、组织或器官中特异性调控基因的过表达、敲低或荧光标记。借助其他调控因子，能实现对靶基因的时间特异性调控，其中GAL80是GAL4的负调控因子，能够抑制GAL4的转录激活[13]。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种“基因敲除”技术，在细胞中引入双链RNA（Double-stranded RNA）与目的mRNA配对，诱导内源靶基因的mRNA降解，从而导致基因表达沉默的现象。果蝇中主要有2个RNAi通路，包括小干扰RNA（si RNA）通路和微小RNA（miRNA）通路。利用UAS-GAL4系统，能够在果蝇中的特定组织和细胞中抑制靶基因的表达。与基因突变相比，构建转基因干扰果蝇成本低、周期短、表型均一以及可重复性高等优点[14]。因此，转基因干扰是研究肿瘤调控基因功能的重要工具。
CRISPR/Cas系统中CRISPR由高度保守的正向重复序列与间隔序列排列组成，Cas基因负责特异性切割DNA双链。CRISPR和Cas基因之间有一段前导序列，启动CRISPR序列转录后，Cas基因使特定区域的双链断裂，诱导修复。相较于单点基因调控技术，CRISPR/Cas系统可同时靶向多位基因，于特定位点进行精确调控和修饰，在解析基因功能和靶向药物开发方面具有独特优势[15-16]。
三、在抗肿瘤药物筛选中的应用
多年来，果蝇模型系统直接或间接地促进了抗癌药物的开发。新药的发现最重要的过程是药物筛选，药物筛选模型要求具备快速性、精准性、特异性强等条件。既具有样品用量少、花费少、实验周期短，又能够实时观测活体体内生理环境的变化，从而实现筛选快速而有效的双重目的[17]。
由于在动物体内，药效的发挥与其吸收、分布及代谢有关，使得利用体外模型筛选的药物在动物体内检测时活性大大降低，甚至无活性。动物模型用于新药筛选，能从整体水平或者个体水平直观地反映出药物的治疗作用、不良反应以及毒性作用。相较于小鼠或大鼠模型，果蝇在新药筛选时具有费用低、时间少、样品用量少等特点，可快速而有效的筛选药物，有助于加速新药的发现。基于果蝇模型的多种优势，已经建立果蝇高通量药物筛选模型，并且在肿瘤药物的筛选中得到了广泛的应用[18]。目前最常用的抗癌药物筛选的模型包括果蝇器官（眼睛、翅膀）、果蝇幼虫和果蝇成虫。Dar等[19]使Ret激酶（dRet）过表达构建患有内分泌瘤2型的果蝇模型，并且通过构建针对Ret的多药理化合物库发现，化合物AD57可以有效地抑制ptc＞dRetMEN2B在幼虫中的致死率。利用Ras基因过表达构建的果蝇肿瘤模型已被应用于药物开发。利用果蝇肿瘤模型构建体内高效筛选平台进行大规模的化合物筛选，在对2000种化合物筛选中发现谷氨酰胺类似物（Acivicin）是果蝇肿瘤形成的特异性抑制剂。结合气管网络的管状结构开发了一种果蝇肺癌模型，探索他汀类药物与MAPK抑制剂（如曲美替尼）联合使用以改善整体治疗指数的潜力，且该模型已成功用于食品和药物管理局（FDA）批准的化合物筛选中[20]。果蝇中JAK/STAT通路被用作筛选FDA批准的药物治疗靶点[21]。研究结果表明JAK/STAT通路与肿瘤的发生有密切的联系，利用果蝇中JAK/STAT通路筛选了2000个小分子，有效小分子甲氨蝶呤和氨基蝶呤，其是JAK-STAT通路的强抑制剂，猜测有效小分子可通过JAK/STAT通路来抑制肿瘤的发生[22]。
利用果蝇强大的遗传工具来研究人类复杂疾病具有悠久的历史。果蝇作为理想的基因筛查模型，被广泛用于研究肿瘤发生和进展的新机制。利用果蝇构建肿瘤研究平台，将继续为癌症生物学中的复杂问题寻找答案，以确定更好的策略和新的靶点来对抗这种疾病。果蝇中的几种细胞信号通路已被用于抗肿瘤药物的靶向研发。应用果蝇肿瘤模型筛选抗肿瘤药物，能提供动物体内生理环境，而且费用低、样品用量少和时间短，有助于加速研发抗肿瘤药物筛选的步伐。
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