结直肠癌病因/治疗相关方面 最新学术研究进展
癌症干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）假说认为，与正常组织相似，有一小部分特化的细胞保留了具有自我更新的能力并持续的发展为肿瘤。癌症干细胞在肿瘤的发生、进展、转移和复发等各个阶段都有涉及，使得它们成为了特别适合的治疗和干预靶标。尽管已有许多文献报道了由众多标记能够用来鉴定癌症干细胞，但这些标记却往往对肿瘤细胞缺乏特异性，因而也能够同样标记正常的组织干细胞[1]。这些标记在癌症干细胞与正常干细胞之间的重叠就带来了这样的问题，即如何在不对正常组织进行破坏的条件下有效地对癌症干细胞进行有效的靶向治疗。除了对肿瘤的特异性缺乏了解，对众多癌症干细胞标记的生物学相关性信息也了解的并不多。因此目前尚不清楚是否这些肿瘤细胞的存活依赖于这样的标记抑或是这些标记的表达仅仅是随环境需要而产生的。
来自于美国Genetech公司的研究人员在其论文中指出，通过化学方法连接于抗体的抗体药物复合物（Antibody drug conjugates, ADCs），以及细胞毒性药物则有可能可以解决这一难题。ADCs识别肿瘤细胞表面的抗体，与其结合、并将细胞毒性药物优选地递送至肿瘤细胞。有些用于ADC癌症治疗的靶向表面分子同时也在正常的组织细胞中有表达，具有临床有效性但却没有毒性[2]。这样的ADC就可以用于靶向这几种肿瘤细胞了[3]。因此，这样的ADC策略就可以应用于去除癌症干细胞而不影响正常干细胞的功能。
一种研究的很清楚的干细胞类群是胃肠道中的LRG5隐秘细胞，其对所有稳态肠道上皮细胞中的所有分化细胞类型都有作用[4]。LRG5+细胞可成为肠道癌症的原始细胞并扮演癌症干细胞的角色，说明去除LRG5+细胞可以对肿瘤生长和维持具有重要的意义[5, 6]。
对来自于Lrg5+细胞的腺瘤性结肠息肉病（APC）突变肿瘤的谱系追踪表明，在肠道肿瘤中的多种细胞类型都源自于Lrg5+祖细胞[6]。此外，Lrg5+细胞还被认为与肿瘤的发生与持续性增长关系密切，提示消除LRG5+细胞可以肿瘤的生长和维持具有重要意义。对于将靶向LRG5+细胞作为治疗策略的一个最重要问题就是，LRG5+是否也在正常的肠道干细胞或者其他细胞上有标记，从而会影响其正常的细胞组织功能[7]。
因此，本研究的目的就在于开发出这样一种治疗策略，其能够允许在不影响正常组织的条件下来选择性靶向LRG5+肿瘤细胞。而本研究的数据也表明，经过适当设计的ADC可以有效地靶向癌症肿瘤细胞，尽管在正常干细胞上也有靶向表达。
研究首先再次对正常组织和肿瘤组织进行了微阵列mRNA表达检测，与之前的报道类似，LGR5在正常的人大肠组织中的表达水平极低，而在直肠癌和卵巢癌中具有相当高的表达水平（见图一）。
图一
癌症干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）假说认为，与正常组织相似，有一小部分特化的细胞保留了具有自我更新的能力并持续的发展为肿瘤。癌症干细胞在肿瘤的发生、进展、转移和复发等各个阶段都有涉及，使得它们成为了特别适合的治疗和干预靶标。尽管已有许多文献报道了由众多标记能够用来鉴定癌症干细胞，但这些标记却往往对肿瘤细胞缺乏特异性，因而也能够同样标记正常的组织干细胞[1]。这些标记在癌症干细胞与正常干细胞之间的重叠就带来了这样的问题，即如何在不对正常组织进行破坏的条件下有效地对癌症干细胞进行有效的靶向治疗。除了对肿瘤的特异性缺乏了解，对众多癌症干细胞标记的生物学相关性信息也了解的并不多。因此目前尚不清楚是否这些肿瘤细胞的存活依赖于这样的标记抑或是这些标记的表达仅仅是随环境需要而产生的。
来自于美国Genetech公司的研究人员在其论文中指出，通过化学方法连接于抗体的抗体药物复合物（Antibody drug conjugates, ADCs），以及细胞毒性药物则有可能可以解决这一难题。ADCs识别肿瘤细胞表面的抗体，与其结合、并将细胞毒性药物优选地递送至肿瘤细胞。有些用于ADC癌症治疗的靶向表面分子同时也在正常的组织细胞中有表达，具有临床有效性但却没有毒性[2]。这样的ADC就可以用于靶向这几种肿瘤细胞了[3]。因此，这样的ADC策略就可以应用于去除癌症干细胞而不影响正常干细胞的功能。
一种研究的很清楚的干细胞类群是胃肠道中的LRG5隐秘细胞，其对所有稳态肠道上皮细胞中的所有分化细胞类型都有作用[4]。LRG5+细胞可成为肠道癌症的原始细胞并扮演癌症干细胞的角色，说明去除LRG5+细胞可以对肿瘤生长和维持具有重要的意义[5, 6]。
对来自于Lrg5+细胞的腺瘤性结肠息肉病（APC）突变肿瘤的谱系追踪表明，在肠道肿瘤中的多种细胞类型都源自于Lrg5+祖细胞[6]。此外，Lrg5+细胞还被认为与肿瘤的发生与持续性增长关系密切，提示消除LRG5+细胞可以肿瘤的生长和维持具有重要意义。对于将靶向LRG5+细胞作为治疗策略的一个最重要问题就是，LRG5+是否也在正常的肠道干细胞或者其他细胞上有标记，从而会影响其正常的细胞组织功能[7]。
因此，本研究的目的就在于开发出这样一种治疗策略，其能够允许在不影响正常组织的条件下来选择性靶向LRG5+肿瘤细胞。而本研究的数据也表明，经过适当设计的ADC可以有效地靶向癌症肿瘤细胞，尽管在正常干细胞上也有靶向表达。
研究首先再次对正常组织和肿瘤组织进行了微阵列mRNA表达检测，与之前的报道类似，LGR5在正常的人大肠组织中的表达水平极低，而在直肠癌和卵巢癌中具有相当高的表达水平（见图一）。
为了制备抗体药物复合物（ADC），研究人员首先制备了用于ADC治疗基础结构的抗LGR5抗体。采用的方法是DNA免疫制备杂交瘤的方法，效果最好的是8E11克隆，其对于小鼠、大鼠和人LGR5的亲和力分别为0.4、2.4和0.2nM，该抗体并不会与LGR4或LGR6发送交叉反应，也并不会调制Wnt信号通路或阻断R-spondin结合。虽然采用标准方法对其进行人源化，获得了hu8E11v2抗体。为了验证LGR5是否适合作为ADC的靶点，将2种作用机理不同的可切除连接药物轭合于hu8E11v2上。第一个药物轭合物是经过临床验证的、含有微管抑制剂通过蛋白酶可降解连接物连接于抗体上链间二硫键的半胱氨酸的单甲基澳瑞他汀E（MMAE）。这一连接物药物技术可用于新近批准的抗CD30 ADC色瑞替尼，用于治疗复发性何奇金氏瘤[8]。第二个连接物药物是NMS818，其含有连接于拓扑异构酶抑制剂蒽环类抗生素PNU159682的C-14羟基的乙酸成分[9]。这两种ADC的活性代谢物具有不同的作用机理，抗有丝分裂（MMAE）和DNA损害（PNU159682）都能够有效地区别作用于正常和肿瘤组织。结果表明抗LGR5-NMS818有广谱范围的肿瘤细胞杀伤作用（见图二）。
图二
在异源移植模型中，与剂量匹配的对照相比，抗LGR5-MC-vc-MMAE与抗LGR5-NMS818都表现出较高的效力，说明在高表达LGR5的条件下，这两种药物在体内都具有类似的效果，10mg/kg就能够使得肿瘤停止生长或缩小。
在肠道肿瘤发生的遗传修饰小鼠模型中，研究人员制备了具有条件性突变KrasG12D的APCmin肠道肿瘤发生模型。在采用抗LGR5-vc-MMAE的治疗组中，肿瘤的增殖率大大降低，且在2周之后发现了LRG5+细胞亦大幅减少。在长期LGR5靶向效果实验中，与对照相比，抗LGR5-ADC治疗组的生存时间要更加延长。
一、FDA批准的结直肠癌伴随诊断
（一）The cobas® KRAS突变试验
The cobas® KRAS突变试验是一种和cobas® 4800系统一起使用的试验，该试验是一种检测福尔马林固定石蜡包埋人体结肠直肠癌肿瘤组织DNA KRAS基因密码子12和13的7种体细胞突变的实时PCR试验。该试验预期用于有资格接受Erbitux（西妥昔单抗）、Vectibix（帕尼单抗）治疗的CRC患者的辅助鉴别，基于无突变的检测结果进行指示。使用cobas® DNA样品制备试剂盒处理标本进行人工样品制备，使用cobas z 480分析仪进行自动扩增和检测。
（二）therascreen KRAS RGQ PCR试剂盒
The therascreen KRAS RGQ PCR试剂盒是一种在Rotor-Gene Q MDx设备上利用福尔马林固定石蜡包埋的人体结肠直肠癌肿瘤组织提取的DNA检测人体KRAS致癌基因7种体细胞突变的实时定性PCR试验。该试验基于无KRAS突变的检测结果预期用于接受Erbitux （西妥昔单抗）、（帕尼单抗）治疗的CRC患者的辅助鉴别。
（三）DAKO EGFR PharmDx试剂盒
EGFR pharmDx™试验是一种用于需要例行组织学评估的正常和肿瘤赘生物组织内表皮生长因子受体鉴别的定量免疫组织化学（IHC）试剂盒系统。该试验尤其能够检测表达EGDR的细胞内的EGFR（HER1）蛋白。该试剂盒系统可以对有资格接受Erbitux（西妥昔单抗）、Vectibix（帕尼单抗）。
二、总 结
结直肠癌是中国的第五大常见癌症是美国的第四大常见癌症，对全球人口的健康有很大的影响。本期内容从最新的NCCN结直肠癌指南检验相关更新，对KRAS、NRAS和BRAF突变检测，微卫星不稳定性（MSI）或错配修复（MMR）检测进行了介绍，对不同的亚型检测进行了剖析。
尽管传统观点认为结直肠癌的发病岁数中位数基本在70岁，但目前在低于50岁年龄段的发病率缺有所上升。因此进行一般性的基因检测也对于常规筛查容易漏检的个体具有补充作用。同时，还对结肠癌患者进行切除术后接受亚叶酸、尿氟嘧啶和奥沙利铂联合或不联合西妥昔单抗的治疗，进行了对BRAF和KRAS突变与预后相关研究，结果表明BRAF V600E和KRAS突变显著与患有微卫星稳定型肿瘤患者较短的无病存活（DFS）以及总存活（OS）相关，与罹患MSI肿瘤患者较短的无病存活（DFS）以及总存活（OS）无关。随着技术手段的进步，对结直肠癌的诊断、治疗也在从单基因单药物向多基因多药物的方向进行转变，因此对结直肠癌的分子亚型进行分型，对实现精准治疗有重大的意义。目前美国癌症协会推荐在50岁之后的人群中，应该每年进行一次便潜血或粪便免疫学化验的筛查，而目前美国FDA批准的结直肠癌相关检测也有Epiprocolon和Cologuard两个不同的试剂盒。除了基因突变意外，肠道微生物菌群的组成，比例与结直肠癌的发病也有重要的关联，探讨肠道微生物菌群的数量以及组成的变化，对于深入了解肠道炎症以及癌症都有着极其重要的意义。期望我们提供的这些内容，能够为结直肠癌领域相关临床医生和研究人员提供一些观点和思路，从而能够更好的服务于患者的早期筛查、检测与治疗，提高患者生活质量，造福社会。
定向点金北美事务总监 Will Xavier
参考文献
1. Nguyen, L.V., et al., Cancer stem cells: an evolving concept.
Nat Rev Cancer, 2012. 12(2）: p. 133-43.
2. Beck, A., et al., Fourth World Antibody-Drug Conjugate
Summit: February 29-March 1, 2012, Frankfurt, Germany. MAbs, 2012. 4(6）: p. 637-47.
3. Mullard, A., Maturing antibody-drug conjugate pipeline hits
30. Nat Rev Drug Discov, 2013. 12(5）: p. 329-32.
4. Barker, N., et al., Identification of stem cells in small
intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature, 2007. 449(7165）: p. 1003-7.
5. Schepers, A.G., et al., Lineage tracing reveals Lgr5+ stem
cell activity in mouse intestinal adenomas. Science, 2012. 337(6095）: p. 730-5.
6. Barker, N., et al., Crypt stem cells as the cells-of-origin of
intestinal cancer. Nature, 2009. 457(7229）: p. 608-11.
7. Haegebarth, A. and H. Clevers, Wnt signaling, lgr5, and stem
cells in the intestine and skin. Am J Pathol, 2009. 174(3）: p. 715-21.
8. Senter, P.D. and E.L. Sievers, The discovery and development
of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma. Nat Biotechnol, 2012. 30(7）: p. 631-7.
9. Quintieri, L., et al., In vitro hepatic conversion of the
anticancer agent nemorubicin to its active metabolite PNU-159682 in mice, rats and dogs: a comparison with human liver microsomes. Biochem Pharmacol, 2008. 76(6）: p. 784-95.
